Participação dos neutrófilos durante a implantação embrionária no desenvolvimento da placenta em camundongos / Participation of neutrophils during embryonic implantation in the placental development in mice

A implantação do embrião na parede uterina é um processo complexo que consiste na interação do blastocisto com as células epiteliais do útero, e depende de diferentes tipos celulares do microambiente uterino. Embora a literatura mostre a participação de neutrófilos neste processo, os dados ainda são incipientes para proposição da função exata destas células nos períodos iniciais da gestação. Dados do nosso grupo de pesquisa mostraram que neutrófilos pró-angiogênicos induzem a tolerância gestacional, e que a depleção de neutrófilos durante as fases iniciais da gestação prejudica a implantação do blastocisto e a progressão da gestação. Com base nestes resultados, o presente estudo visou investigar se a depleção de neutrófilos na fase pré-receptiva da janela de implantação do blastocisto altera a morfologia placentária. Para tanto, foi utilizado o modelo de gestação alogênica, onde camundongos fêmeas C57BL/6, após cruzamento com machos Balb/C foram tratadas com anticorpo anti-Ly6G ou isotipo no dia 1,5 da gestação (24 horas após a detecção do plug vaginal) em dose suficiente para manter a depleção de neutrófilos circulantes por 48 horas (200µg/ 500µL; i.p). No final da gestação (dia 18,5), o sangue periférico foi coletado e, em seguida, os animais foram submetidos a laparotomia para retirada da placenta, a qual foi submetida à análise histológica. As análises dos leucócitos circulantes evidenciaram a efetividade do tratamento para depleção de neutrófilos periféricos. A análise histológica mostrou alterações significativas na morfologia da placenta nos animais tratados com anti-Ly6G. Foram detectadas a redução da zona juncional, de células trofoblásticas e de fatores angiogênicos, como fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), e das moléculas de adesão intracelular-1 (ICAM-1) e de plaqueta e endotélio (PECAM-1). Esses dados evidenciam a importância dos neutrófilos nos primeiros dias de gestação para o desenvolvimento da placenta

Blastocyst implantation is a complex process, consisting of the interaction between blastocyst and uterine epithelial cells. Also, it is well known that the implantation site resembles an inflammatory response, with a profusion of recruited immune cells into the endometrial stroma and lumen from the blood. The role of macrophages, natural killers, and dendritic cells have been extensively studied, however, the participation of neutrophils in this process remains unclear. Data from our research group showed that pro-angiogenic neutrophils induced gestation tolerance, also peripheral neutrophils depletion at the time of active placental development led to smaller embryo sizes and abnormal placentation in mice. In this context, the present study aimed to investigate whether pharmacological depletion of neutrophils in mice in the blastocyst implantation phase alters placental morphology. Therefore, C7/BL/6 female mice, after mating with Balb/C males, were treated with an anti-Ly6G antibody or isotype on day 1 of gestation (after detection of the vaginal plug) at a dose sufficient to maintain the depletion of circulating neutrophils for 48 hours (200 µg/500µL; i.p). At the end of the gestational day (day 18), peripheral blood was collected, and then the animals were submitted to laparotomy for the placenta removal and subsequent histological analysis. The analysis of circulating leukocytes from neutrophils depleted mice showed a reduction of peripheral neutrophils up to 48 hours after antibody injection. The histological analysis showed significant alterations in the placenta morphology of the animals treated with anti-Ly6G. The morphometric analyses showed a reduction in the size of neutrophils depleted placenta due to diminished junctional zone and reduction of trophoblast cells. Also, it was observed a reduction of vascular endothelial growth factors (VEGF), reduction of adhesion molecules intracell-1 (ICAM-1), and platelets and endothelium (PECAM-1) positive cells in the junctional zone. In conclusion, these data show the importance of neutrophils on the first days of pregnancy for the development of the placenta

Efecto de la concentración de crioprotectores sobre la viabilidad post vitrificación de embriones murinos (mus musculus) / Effect of cryoprotectant concentration on the post vitrification morphological viability of murine embryos (mus musculus)

Con la finalidad de determinar la mejor solución de vitrificación (SV), usando Etilenglicol (EG), Glicerol (G) y Sucrosa (SUC), se evaluó la apariencia morfológica post vitrificación de embriones murinos (Mus musculus). Ocho mezclas diferentes de crioprotectores fueron evaluadas, con las siguientes concentraciones: SV1: 0% de crioprotectores; SV2: 50% EG; SV3: 50% G; SV4: 50% SUC; SV5: 25% EG + 25% G; SV6: 50% EG + 0,3M SUC; SV7: 50% G + 0.3M SUC y SV8: 25% EG + 25% G + 0,3M SUC. El mayor número de embriones (94,7%) con apariencia morfológica normal, fueron los equilibrados con SV5. No hubo diferencia significativa entre la SV8 (88,9%) y la SV5. Mientras que los embriones criopreservados con las soluciones restantes, presentaron viabilidad morfológica más baja (p<0,05). Estos resultados sugieren que la SV5 provee mejor tolerancia al proceso de vitrificación, observándose en los embriones la más alta viabilidad y la más baja frecuencia de anormalidades morfológicas. Estos hallazgos contribuyen de manera importante, en la selección de los crioprotectores para la vitrificación.

In order to determine the best vitrification solution (VS), using ethylene glycol (EG), glycerol (G) and sucrose (SUC), the post vitrification morphology in murine embryos (Mus musculus) was evaluated. Eight different mixtures of these chemicals, with the following concentrations: VS1: 0%; VS2: 50% EG; VS3: 50% G; VS4: 50% SUC; VS5: 25% EG + 25% G; VS6: 50% EG + 0.3M SUC; VS7: 50% G + 0.3M SUC and SV8: 25% EG + 25% G + 0.3M SUC, were used. VS5 was the solution with the highest percentage (94,7%) of embryos with normal morphology. There were no significant differences between the VS8 (88.9%) and VS5. However, embryos cryopreserved with the other solutions had a lower morphological viability (p<0.05). These results suggest that VS5 provides embryos with better tolerance to the vitrification process, because a higher viability and lower frequency of morphological abnormalities were present. These findings provide details of great importance to the selection of cryoprotectants for vitrification.

Metabolismo embrionário no período pré-implantação / Preimplantation embryo metabolism

Há décadas os pesquisadores tentam elucidar as bases fisiológicas e metabólicas do desenvolvimento embrionário. No que diz respeito ao período pré-implantação, a maior parte das informações foi obtida a partir de estudos com modelos animais devido, sobretudo aos impedimentos éticos e legais envolvidos na pesquisa com embriões humanos. Frequentemente, os trabalhos sobre desenvolvimento embrionário pré-implantação envolvem temas como requerimento energético, atividade mitocondrial, controle da expressão gênica, biossíntese de macromoléculas, comunicação intra e intercelular e resposta ao estresse. Entender como se dá o desevolvimento de blastocistos de alta qualidade é de grande importância para melhorar as condições de cultivo de embriões e, conseqüentemente, aumentar o sucesso dos ciclos de reprodução assistida. Neste estudo serão descritos os principais aspectos do desenvolvimento embrionário desde a fecundação até o estágio de blastocisto. Serão enfocadas as principais necessidades metabólicas, de que maneira a cultura de embriões em ART supre estas necessidades e as conseqüências do desenvolvimento in vitro no metabolismo embrionário.

Concentração espermática e tempo de incubação na fecundação in vitro usando-se sêmen de touros da raça Guzerá / Sperm concentration and incubation period on in vitro fecundation using sperm of Guzera bulls

Estudou-se o efeito da concentração espermática e período de incubação e da interação dessas características sobre a fecundação in vitro (FIV) usando-se sêmen de touros Guzerá. Oócitos (n=1146) maturados in vitro foram divididos em tratamentos objetivando a FIV, em esquema fatorial 3×2×2 (três touros - A, B e C, duas concentrações espermáticas - 2 e 4×10(6) espermatozóides/ml e dois tempos de incubação 12 e 18 horas). Utilizaram-se espermatozóides viáveis obtidos por swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5 por cento de CO2 e 95 por cento de umidade, a 38,5°C. Após incubação, 50 por cento dos oócitos foram fixados e corados para determinação das taxas de penetração, fecundação monoespermática e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da granulosa em meio CR2aa por oito dias, avaliando-se a taxa de clivagem e a produção de blastocisto. Houve maior taxa de penetração (P<0,05) na concentração de 4×10(6) espermatozóides/ml por 18 horas (64 por cento), e não se observou diferença (P>0,05) entre os demais tratamentos. A taxa de poliespermia foi maior (P<0,05) na concentração espermática de 4×10(6), independente do tempo de incubação. Na concentração espermática mais alta, a taxa de poliespermia foi maior no tempo de incubação de 18 horas (P<0,05). O touro A apresentou menor (P<0,05) taxa de poliespermia em relação aos demais. Ainda, no touro A a taxa de clivagem foi maior (P<0,05) que no touro B, enquanto o C mostrou-se semelhante tanto ao A quanto ao B. O tempo de incubação, a concentração espermática e a interação das variáveis influenciaram as taxas de penetração e poliespermia, sem interferir na taxa de fecundação monoespermática e na produção de blastocistos.

The effects of sperm concentration, incubation period and their interaction on in vitro fertilization (IVF) using sperm of Guzera bulls were evaluated. In vitro matured oocytes (n=1146) were allotted to IVF treatments in a factorial scheme 3×2×2 - three bulls (A, B and C), two sperm concentrations (2 and 4×10(6) spermatozoa/ml) and two incubation periods (12 and 18h). Viable spermatozoa were obtained by swim-up. The IVF was performed using in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5 percent CO2 and 95 percent humidity, at 38.5°C. After the incubation, 50 percent of oocytes were fixed and stained to determine penetration, monospermic fecundation and polyspermy rates. The remainder was co-cultured with granulosa cells in CR2 medium for eight days to evaluate cleavage and embryo production rates. The penetration rate was higher (P<0.05) for sperm concentration of 4×10(6) spermatozoa/ml incubated for 18 hours (64 percent), and no differences (P>0.05) among remainder treatments were observed. The polyspermic rate (P<0.05) was higher for higher sperm concentration and incubation period. Bull A showed the lowest (P<0.05) polyspermy rate. Bulls A and C showed higher (P<0.05) cleavage than bull B. Incubation period, sperm concentration, and interaction of these two factors influenced penetration and polyspermy rates, without any effect on monospermic fecundation rates and embryos production.

Utilização do primeiro ciclo ovulatório da estação reprodutiva para produção de embriões em éguas sob condições tropicais / Utilization of the first ovulatory cycle of seasonal breeding for embryo production in mares in tropical conditions

A eficiência da primeira ovulação da estação reprodutiva para a produção de embriões foi determinada através da taxa de recuperação embrionária, da viabilidade dos embriões recuperados, da concentração sérica de progesterona, da resposta do primeiro folículo pré-ovulatório da estação reprodutiva ao hCG e da resposta do primeiro CL a PGFa alfa. Treze éguas que estavam no periodo de anestro ou inicial da transição de primavera foram acompanhadas por ultra-sonografia até a detecção do primeiro folículo pré-ovulatório. Neste momento a ovulação foi induzida com 2500 UI de hCG (IV) e elas foram inseminadas em dias alternados até a ovulação. Sete dias após a detecção da ovulação foi realizada coleta de embrião e a concentração de P 4 foi determinada. A partir da detecção do primeiro folículo > e =25mm da estação, as éguas demoraram em média 14,92± 10,80 dias para alcançarem o primeiro folículo pré-ovulatório e 18,00 ±11,08 dias para ovularem, sendo que 11/13 éguas ovularam em até 48 horas após a administração do hCG. Estes folículos cresceram em média 2,19± 0,86 mm/dia. Nove das 13 éguas (69,2%) produziram embriões e todos foram considerados viáveis após avaliação visual e pelo exame de fluorescência. Os corpos lúteos formados mostraram-se funcionalmente competentes produzindo em média 7,39 ± 2,11 ng/ ml de P 4, além de serem responsivos à PGF2alfa. Deste modo, o primeiro ciclo ovulatório do ano pode ser utilizado com sucesso para a produção de embriões viáveis.

The efficacy of the first ovulation of the breeding season was determined through the response of first pre-ovulatory follicle of the breeding season to hCG, embryo recovery rate, viability of recovered embryos, serum concentrations of progesterone, and response of first CL to PGF2 alpha. Thirteenth mares that were in vernal transition were accompanied until the first pre-ovulatory follicle was detected. At this moment, the ovulation was induced with 2,500 IU hCG (IV) and the mares were inseminated every other day until ovulation. Seven days after the ovulation, embryo recovery was performed and the progesterone concentration was determined. After detection of the first pre-ovulatory follicle of breeding season with > and = 25mm, it took 14.92 ± 10.80 days for the follicle to reach the pre-ovulatory size and 18.00 ± 11.08 days to ovulation. After administration of hCG, 11/13 mares ovulated in 48 hours. These follicles growth 2.19 ± 0.86 mm/ day on average. Nine of 13 mares (69.2%) produced embryos and ali were considered viable after morfological evaluation and fluorescence exams. The CL appeared competent producing 7.39 ± 2.11 ng/ml P4 on average, and responding to PGF2 alpha. According to these results the first ovulatory cycle of the year can be utilized to produce viable embryos.

La realidad del Embrion Humano en los primeros quince dias de vida / The reality of the Human Embryo in the first fifteen days of life

El embrión temprano no es un simple tejido homogéneo e indiferenciado. El cigoto (o fase unicelular del individuo) se constituye, a partir del material heredado de los progenitores, como una célula con organización polarizada y con una propiedad peculiar que la distingue de cualquier otra célula: contiene el plano de las primeras divisiones celulares y se organiza en una unidad vital, tanto en sus estructuras espaciales como en sus funciones. Es un organismo en su fase inicial más sencilla y no una mera célula. El concepto de preembrión (aplicado al embrión preimplantatorio), como una fase del desarrollo en que no ha alcanzado el carácter de individuo de la especie, por la posibilidad de dar origen por división a gemelos monocigóticos, carece de fundamento biológico. Un embrión no se parte en dos mitades porque es asimétrico y las diversas células que lo componen son diferentes entre sí, desde el estado de dos células. El estatus del embrión preimplantatorio (generado naturalmente o creado in vitro) es el mismo: individuo de la especie humana. In vitro disminuye drásticamente la capacidad de un correcto desarrollo, en simbiosis armonizada con la madre; pero no significa menor humanidad, sino que siendo un ser humano, se le ha generado y situado en unas circunstancias en las que la capacidad de seguir viviendo está limitada

Partial rescue of the Na+-Ca2+ exchanger (NCX1) knock-out mouse by transgenic expression of NCX1

The null mutation of cardiac Na+-Ca2+ exchanger (NCX1) gene in mice caused death of embryo in utero at embryonic day (ED) 9.0-9.5 and this embryonic lethality appears resulted from abnormal heart development. In the present study, we investigated whether transgenic re-expression of NCX1 in mutant cardiac myocytes could rescue these lethal defects. Transgenic mice expressing the canine NCX1 in a cardiac specific manner were bred into the NCX1 knock-out background but did not prevent the fetal lethality associated with the NCX1 null allele. However, the NCX1 knock-out embryos with an NCX1 transgene survived with heart beatings until ED 10.5 which was one day longer than the survival of the NCX1 knock-out embryos (ED 9.5). At ED 10.5, however, the partially rescued NCX1 embryos might have succumbed to the lack of an organized vasculature in the yolk sacs. The placental labyrinth layer was reduced in size and largely avascular. The transgenic re-expression of NCX1 rescued heart beatings and survived longer, but was still insufficient for the mice to be completely rescued. Importantly, NCX1 was observed to express in the yolk sac and the placenta of wild type mice. The results suggest that defects in extra-embryonic compartments are causal to the lethality, and that NCX1 may play an important role in establishing vascularization in extra-embryonic tissues.

Growth factors and embryo development

In this review are cited and discussed the possible roles of growth factors on preimplantation embryo development of different species. In first term, is considered the mRNA detection in early stages of development. The distribution pattern was not uniform for the different peptides evaluated. For some of them, the mRNAs are detected at the oocyte stage and the level declines to the blastocyst stage, which suggests a maternal origin for them. For others, the level increased from 2-4 cells to blastocyst stage. On the other hand, transcripts of growth factor receptors have been detected in preimplantation embryos. This suggests that growth factors of maternal or embryo origin interact with specific receptors on preimplantation embryo surface and regulate the early development. On the other hand, culture media supplemented with different growth factors have been used to study the possible effects on in vitro development. Some investigators have found no effect. Others, however, have demonstrated changes in protein synthesis, cell number, differentiation and hatching processes. Embryo development modulation by growth factors probably involves a balance between stimulatory and inhibitory effects, although works are needed to determine the precise roles played by these polypeptides during early stages of mammalian development.

La hipoglucemia como factor de riesgo sobre el desarrollo embrionario en diabetes mellitus. Revisión bibliográfica / Hypoglycemia as a risk factor on the embrionary development in diabetes mellitus

La hipoglucemia, o disminución de la concentración normal de glucosa en sangre, es una secuela importante en el control estricto en pacientes diabéticos tipo 1. En mujeres diabéticas embarazadas, la hipoglucemia al parecer no afecta en gran medida el desarrollo embrionario o fetal; mientras que en roedores, es una importante causa de teratogénesis y/o embriotoxicidad, cuando se presenta durante la organogénesis. A pesar de las diferencias metabólicas, endocrinas y temporales de la gestación en humano y roedor, debe considerarse un posible daño al producto por la hipoglucemia durante el embarazo diabético en humanos